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类型 基础研究 预答辩日期 2018-05-18
开始(开题)日期 2015-09-15 论文结束日期 2018-03-09
地点 东南大学四牌楼校区李文正楼南213 论文选题来源 973、863项目     论文字数 5 (万字)
题目 GABAA受体的节律性降解及其调控睡眠
主题词 Fbxl4蛋白,GABAA受体,节律系统调节,睡眠,果蝇
摘要 睡眠是一种自发的、可逆的行为状态,睡眠过程中伴随着主观意识下降,对 外界刺激反应降低。睡眠行为高度保守,从低等动物到高等哺乳动物都具有睡眠 及睡眠样的行为。研究发现,睡眠主要受到生物节律和睡醒稳态两个内在系统调 控。目前,对于哺乳动物的中央节律神经元核团参与睡眠调控相关分子机制的研 究不是很清晰。同时,研究人员发现果蝇中也存在睡眠样行为,果蝇的节律系统 与哺乳动物的同源性很高。因此本论文以果蝇为模式动物,运用了遗传学、分子 生物学、电生理技术以及行为学等生物手段解析了Fbxl4蛋白在腹外侧神经元 (l-LNvs)中动态表达,从而介导GABAA受体节律性降解来调节睡眠的相关分 子机制。 研究发现,腹外侧神经元(l-LNvs)的GABAA受体在清晨和黄昏的含量不 同,除了Wake蛋白在黄昏时对GABAA受体募集的作用外,主要是GABAA受体在 清晨和黄昏时分被降解速率的不同,表现为清晨降解快、黄昏降解慢,而GABAA 受体的转录水平并没有动态变化,而影响GABAA受体蛋白水平的动态变化主要 是GABAA的合成和降解。通过RNAi筛选,我们发现Fbxl4蛋白敲减后,GABAA 受体蛋白水平增加;随后体内体外泛素化实验结果显示Fbxl4通过介导GABAA受 体第二个胞内端泛素化,从而降解GABAA受体。研究还发现Fbxl4的转录水平是 CLOCK依赖的,从而介导GABAA受体的节律性降解。通过免疫荧光染色显示, Fbxl4在清晨时分(ZT0)表达量达到高峰,而黄昏时分(ZT12)表达量较低, 同时我们发现Fbxl4对GABAA受体的降解是剂量依赖的,这暗示着Fbxl4蛋白在清 晨时分(ZT0)对GABAA受体的降解过程是动态变化的。全细胞电生理记录了腹 外侧神经元(l-LNvs)的自发放电模式,结果显示与野生型相比,fbxl4突变体的 腹外侧神经元(l-LNvs)的动作电位自发放电频率更低,这说明Fbxl4蛋白缺失 I 会降低腹外侧神经元(l-LNvs)细胞活性。而饱和GABA喷射实验结果显示fbxl4 突变体中GABA电流幅度更大,说明Fbxl4蛋白缺失后位于腹外侧神经元(l-LNvs) 细胞膜上的GABAA受体数量比野生型更多,从而影响了腹外侧神经元(l-LNvs) 的细胞活性。因此,我们对野生型和fbxl4突变体果蝇的睡眠行为检测时发现,fbxl4 突变体的睡眠基线比野生型高,睡眠潜伏期比野生型短。不仅如此,fbxl4突变体 可以部分挽救腹外侧神经元(l-LNvs)中GABAA受体减少睡眠降低的表型,这 进一步说明Fbxl4蛋白对GABAA受体节律性降解来调控睡眠。 本论文研究揭示了fbxl4基因转录水平受到重要节律分子CLOCK调控,而 Fbxl4蛋白在腹外侧神经元(l-LNvs)中节律性降解GABAA受体,从而对睡眠具 有一定调控作用。这项研究阐明了节律系统怎样通过调控下游分子Fbxl4蛋白的 动态变化,从而调控睡眠和觉醒的发生,为节律系统如何影响睡眠稳态系统的研 究搭建了桥梁,提供了新的研究线索。
英文题目 Characterize the Mechanism of Rhythmic Degradation of GABAA Receptor and its Role of Regulating Sleep
英文主题词 GABAA receptor degradation, Circadian rhythm, Sleep, Fbxl4
英文摘要 Sleep is an essential, evolutionarily conserved behavior. It is regulated by circadian rhythm and homeostatic mechanism. Circadian rhythm regulates timing of sleep, and homeostatic mechanism influences the amout of sleep. However, how the output of circadian clock determines the timing of sleep is still unknown. In vertebrates and invertebrates, sleep and wakefulness is modulated by the electrical activity of pacemaker neurons that are circadian-regulated and suppressed by inhibitory GABAergic inputs. Here, in Drosophila we found the protein level of RDL, homologous to mammalian GABAA receptor, changed dynamically in the large ventral lateral clock neurons(l-LNvs). And the whole-cell patch-clamp electrophysiological recordings of the l-LNvs neurons showed that fast GABA-mediated currents are correspondingly enhanced at night III compared to the day. Through RNAi screen, we found Fbxl4 mediates GABAA receptor ubiquitination and degradation. In fbxl4 mutant, endogenous GABAA receptor of the l-LNvs neurons was accumulated at the daytime. Meanwhile, the protein level of Fbxl4 alters across the 24 hr day and the transcription of fbxl4 in l-LNvs is CLOCK-dependent. We also performed whole-cell patch-clamp recordings of the fbxl4 mutant, and the spontaneous action potential rate in fbxl4 mutant is slower than wild type at dawn. And fbxl4 mutant shows more sensitivity in the saturated-GABA puff experiment. Consequencely, fbxl4 mutant shows increase sleep and short latency. We propose that Fbxl4, as a clock output molecule, was expressed dynamically in the l-LNvs neuron. And Fbxl4 mediates RDL degradation, leading to increase sleep. It offers evidence to understand the relationship of circadian rhythm and homeostatic mechanism.
学术讨论
主办单位时间地点报告人报告主题
东南大学生命科学研究院 2016.07.21 李文正楼北225 李倩 Gilal dysfunction causes age-related memory impairment in Drosophila
东南大学生命科学研究院 2017.03.17 李文正楼北225 李倩 TRPA1mediates sensation of the rate of temperature change in Drosophila larvae
东南大学生命科学研究院 2014.06.17 李文正楼北225 李倩 Dissecting the mechanisms of presynaptic distribution of Neurexin and functions of Nlg3 in synaptogenesis
东南大学生命科学研究院 2017.10.10 李文正楼北225 李倩 Fbxl4 Serves as a Clock Output Molecule that Regulates Sleep through Promotion of Rhythmic Degradation of the GABAA Receptor
东南大学生命科学研究院 2017.02.21 李文正楼北225 李倩 Fbxl4 regulates sleep by mediating Rdl degradation in Drosophila
东南大学生命科学研究院 2015.12.20 李文正楼北225 李倩 The F-box protein Fbxl4 mediates sleep in Drosophila
东南大学生命科学研究院 2016.12.02 李文正楼北225 李倩 Single serotonergic neurons that modulate aggression in Drosophila
东南大学生命科学研究院 2016.10.11 李文正楼北225 李倩 Fbxl4 regulates sleep by mediating Rdl degradation in Drosophila
     
学术会议
会议名称时间地点本人报告本人报告题目
The 4th Asia-Pacific Drosophila Research Conference 2017.05 日本,大阪 Fbxl4 regulates sleep by mediating Rdl degradation in Drosophila
中国细胞生物学学会2017全国学术大会 2017.09 福建,厦门 Fbxl4 regulates sleep by mediating Rdl degradation in Drosophila
江苏省发育生物学学会 2014.06 江苏,南京 Fbxl4 regulates sleep by mediating Rdl degradation in Drosophila
     
代表作
论文名称
Fbxl4 作为节律输出分子通过介导GABAA受体降解调节睡眠
 
答辩委员会组成信息
姓名职称导师类别工作单位是否主席备注
王光辉 正高 教授 博导 苏州大学
李家大 正高 教授 博导 中南大学
刘畅 正高 教授 博导 中国药科大学
方明 正高 教授 博导 东南大学
赵春杰 正高 教授 博导 东南大学
      
答辩秘书信息
姓名职称工作单位备注
田垚 其他 讲师 东南大学